TOPO克隆PCR产物的纯化回收

在进行PCR反应后，需要对产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，以确认是否存在目的大小的条带。

推荐使用切胶回收的方法进行纯化，切胶时间最佳控制在3分钟以内，以避免紫外线对DNA造成损伤。回收的浓度可通过NanoDrop或OneDrop等仪器检测，应达到≥30ng/μl，并再次进行电泳判断是否仅存在目的条带。

目的片段连接至载体

连接反应体系应按照说明书的要求进行，各组分体积≥1μl。如浓度过高，可以适当稀释后使用。建议连接反应温度在25°C或37°C进行，反应时间可初步设定为5分钟。如果没有成功克隆或遇到空载体/假阳性问题，可以尝试将时间延长至30分钟。

感受态转化及涂板

1. 对于连接产物的转化，推荐使用DH5α、Fast-T1等克隆用的化学感受态细胞。

2. 感受态细胞不可反复冻融，一旦从-80°C取出，建议一次性用完。

3. 重组产物体积与感受态细胞体积的比例应为1:10，推荐10μl的重组产物加入至100μl感受态细胞或5μl重组产物加入至50μl感受态细胞。

4. 热激时间需依照感受态细胞的说明书进行操作。

5. 平板的抗生素抗性需要与转化的载体抗性保持一致。

6. 在涂板时，菌液需离心（2500×g，3分钟），然后吸取并丢弃多余的LB培养基，保留100μl重悬后全部涂板，或吸取适量的体积涂板。

单克隆菌落PCR鉴定

1. 从平板中挑取体积适中的单克隆菌落，避免选择过大或过小的菌落。

2. 挑取多个单克隆菌落进行鉴定分析。

3. 将挑取的菌落放入已添加10μl ddH2O的15ml或2ml EP管中，充分溶解混匀后，吸取1-2μl作为PCR反应（10/20μl体系）的模板。

4. 推荐使用一对分别位于目标片段和载体的上下游引物进行PCR鉴定。

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