荧光定量PCR（Real-time PCR）是一种在PCR扩增反应中加入荧光基团的方法，能够实时检测每个循环产物的荧光信号，通过标准曲线对未知模板进行定量分析。以探针法为例，在PCR扩增过程中，与引物同时加入的一种特异性荧光探针在DNA单链上结合，报告荧光基团发出的信号被淬灭基团吸收，因此在扩增初期无法检测到荧光信号。然而，随着PCR扩增的进行，Taq酶会降解探针，释放报告荧光基团，从而生成可检测的荧光信号，这种信号的累积与PCR产物的形成完全同步。

传统PCR在检测时需要后续的染色处理和电泳分离，且只能进行定性分析，定量不够精确，并且容易出现污染导致假阳性，从而限制其应用。相比之下，实时定量PCR技术不仅可以定量分析模板，还具备高灵敏度、特异性和可靠性，自动化程度高且无污染。因此，荧光定量PCR逐渐取代了常规PCR方法。在PCR扩增的初始几个循环中，荧光信号变化不大，形成接近直线的基线，随后进入指数增长期。在此期间，可以设定荧光阈值线，通常设定为3-15个循环的荧光信号标准偏差的10倍。每个反应管内荧光信号达到阈值所需的循环数称为CT值，这个值与初始浓度的对数呈线性关系，且具有良好的重现性。

CT值的主要用途是计算目的基因的表达量，其中涉及到绝对定量和相对定量两个概念。绝对定量旨在测定目的基因在样本中的分子数（拷贝数），而相对定量则用于比较多个样本中目的基因的相对比例，而不需要知道具体的拷贝数。绝对定量实验需使用已知拷贝数的绝对标准品并绘制标准曲线，而相对定量可以选择性地使用或不使用标准曲线。由于绝对标准品製作难度大，许多实验室通常采用相对定量方法进行比较基因表达。

荧光定量PCR的应用领域

自荧光定量PCR被发明以来，其在生物医疗领域的广泛应用显著推动了科学研究的发展，主要包括以下几个方面：

1. 核酸定量分析：对传染病进行定量和定性分析，包括病原微生物或病毒含量检测，如近期流行的甲型H1N1流感、转基因动植物的基因拷贝数检测、RNAi的基因失活率等。
2. 基因表达差异分析：比较不同处理样本中特定基因的表达差异（如药物、物理或化学处理）及cDNA芯片或差异显著结果的确认。
3. SNP检测：单核苷酸多态性在研究个体对不同疾病的易感性或对某些药物的反应中具有重要意义，基于分子信标结构的高通量SNP检测变得简单且准确。
4. 甲基化检测：与疾病（尤其是癌症）密切相关，采用Methylight技术，能够区分甲基化和非甲基化的DNA，具有更高的灵敏度。
5. 产前诊断：对于遗传性疾病的监测至关重要，通过实时PCR技术检测母体血液中的胎儿DNA，为临床提供了无创伤的解决方案。
6. 病原体检测：荧光定量PCR技术可用于多种病原体的定量检测，相比传统方法，具有高灵敏度、少量样品和快速便捷等优点。
7. 药物疗效考核：定量分析乙型和丙型肝炎病毒，阐明病毒量与药物效果之间的关系，指导临床治疗。
8. 肿瘤基因检测：实时荧光定量PCR能够有效检测基因突变及癌基因表达，广泛应用于多种肿瘤相关基因的检测。

随着技术的不断进步，荧光定量PCR的应用将更加广泛，其在生物医学领域的贡献将不断增加，正如尊龙凯时人生就博所强调的，创新是推动科学进步的动力。