双抗体夹心法是生物医疗中检测抗原的常用方法，具体操作步骤如下：

一、固相抗体的制备

首先，将特异性抗体与固相载体结合，以形成固相抗体。接下来，通过洗涤步骤除去未结合的抗体和杂质，以确保固相抗体的纯度和特异性。

二、受检标本的添加

将待检标本加入，使其与固相抗体反应一段时间，以促使标本中的抗原与固相载体上的抗体结合，形成固相抗原复合物。之后，再次洗涤以去除未结合的物质。

三、酶标抗体的结合

接下来，加入酶标抗体，使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体相结合。随后，彻底洗涤未结合的酶标抗体，此时固相载体上的酶量与标本中待检物质的量呈正相关。

四、底物的添加与检测

最后，加入底物，酶催化底物生成有色产物。通过监测颜色反应的程度即可定量或定性该抗原。这种双抗原夹心法同样可用于检测样本中的抗体，只需分别制备固相抗原和酶标抗原的结合物。

临床应用与注意事项

在临床检验中，这种方法适用于检测各类蛋白质等大分子抗原，如HBsAg、HBeAg、AFP及hCG等。只需获得针对受检抗原的异性抗体，即可用于包被固相载体和制备酶结合物。如抗体来源为抗血清，最理想的做法是使用不同种属动物获得的抗体。若采用单克隆抗体，通常选取两个针对同一抗原不同决定簇的单抗来分别用于固相载体和酶结合物的制备。此双位点夹心法具备高特异性，并可以在同一反应条件下进行样本和酶标抗体的混合检测，形成一步法检测。

钩状效应的考量

在一步法检测中，若待检标本中的抗原含量极高，则可能与固相抗体及酶标抗体结合，导致“夹心复合物”的形成受阻。这类似于沉淀反应中的抗原过剩现象，此时显色后的吸光值可能与标准曲线中的某一抗原浓度相同，这种现象被称为钩状效应（hook effect）。该效应可能导致显色不明显甚至假阴性结果。因此，在使用一步法试剂检测可能异常增高的物质（如血清中的HBsAg、AFP或尿液中的hCG等）时，需注意可测范围的上限。使用高亲和力的单克隆抗体可以帮助减轻钩状效应的影响。

亚型与干扰因素

在检测HBsAg时，需要特别关注亚型问题，HBsAg存在adr、adw、ayr及ayw四个亚型，这些亚型虽然具有相同的a决定簇反应性，但使用单抗夹心法时需要予以注意。此外，类风湿因子（RF）作为一种自身抗体，可能在双抗体夹心法的检测中造成干扰，导致假阳性结果。使用F(ab')或Fab片段作为酶结合物的试剂，可以有效消除RF的干扰。在选用双抗体夹心法的ELISA试剂时，是否受RF的影响也是考核其性能的重要指标。

总结

双抗体夹心法适用于测定二价或三价以上的大分子抗原，但不适合测定小分子或单价半抗原，因为它们无法形成双位点夹心结构。此方法与相似的检测模式不同的是，采用特异性抗原进行包被和制备酶结合物以检测相应的抗体。与间接法不同的是，此法利用酶标抗原代替酶标抗体，能够在不稀释样本的情况下直接进行测定，因此其灵敏度通常高于间接法。乙肝标志物中抗HBs的检测常采用这一方法，关键在于酶标抗原的制备，应根据抗原的不同结构选择合适的标记方法。尊龙凯时人生就博致力于提供高质量的生物医疗检测工具，帮助您进行精确的健康监测。