一、实验准备

人多能干细胞培养基配制

（1）在2-8℃条件下解冻hPSCMediumSupplement，融化后轻轻晃动以确保均匀混合，按实际需求进行分装，立即使用或储存于-20~-80℃，避免反复冻融；

（2）将10mL的hPSCMediumSupplement以1:50的比例加入到500mL的hPSCMediumBasalMedium中，混合均匀形成人多能干细胞培养基(abs9403)；注意：这种培养基在成功混合后可以在2-8℃下稳定保存2-3周，不建议使用超过3周的培养基。

（3）实验前调整实验试剂至室温并避光平衡；PBS和消化液等需加热至37℃。特别注意：培养基中含有敏感因子，不宜在37℃水浴中加热。

二、操作方法

(所有步骤需在无菌条件下进行)

hPSC细胞复苏

1. 基质胶包被培养板：取出6孔板或12孔板，每孔加入1mL或0.5mL即用型基质胶(abs9410)，轻轻晃动使其完全覆盖培养皿底部，放入37℃培养箱孵育1-2小时，实验前在超净工作台或生物安全柜中平衡20分钟。如暂时不使用，可用Parafilm封口后在2-8℃储存，建议于1周内使用。注意：每支冻存的干细胞数量约为1×10^6 cells/mL，对应6孔板的一个孔；即用型基质胶应与温度敏感，使用后立即放回4℃冰箱，避免手直接接触基质胶表面，以免影响其质量。

2. 预备2-3mL的干细胞培养基于15mL离心管中备用。

3. 解冻：将冻存管从液氮中快速取出，迅速浸入37℃温水中，摇动使其在1-2分钟内快速解冻；注意，尽量减少细胞在室温下的暴露时间。

4. 离心：冻存管中的冻存液解冻后，将其逐滴加入到含有干细胞培养基的15mL离心管中，平衡后以1000rpm离心3分钟。

5. 重悬：弃去上清，加入1mL人多能干细胞培养基对细胞沉淀进行轻柔的吹吸混匀，建议进行3-5次。

6. 接种：均匀吹吸后，丢弃已平衡好的即用型基质胶，将均匀的干细胞悬液加入已包被的6孔板中，并补足每孔2mL培养体系。

7. 培养：接种后，可以在倒置相差显微镜下观察细胞密度和团块大小，合格的细胞团块应由4个以上的细胞组成。轻轻晃动6孔板或12孔板使细胞均匀分布，置于37℃、5% CO2的恒温培养箱中培养，并在第二天观察细胞贴壁情况。

8. 换液：从复苏时开始每24小时换液一次；由于培养基中的活性成分只能维持一天，每24小时需及时更换新鲜培养基。

hPSC细胞传代

1. 清洗：吸去原有的培养基，贴壁缓慢加入1mL PBS缓冲液并轻轻晃动，然后沿培养皿边缘吸去PBS缓冲液。

2. 消化：每孔加入2mL人多能干细胞消化液(abs9409)覆盖皿底，置于37℃培养箱中2-5分钟；消化时间依据细胞生长密度而变化。一般建议时间为2-5分钟，消化过程中可利用倒置显微镜观察细胞消化情况，若观察到大部分克隆边缘及内部细胞间出现间隙，可吸去消化液终止消化。

3. 吹打：吸去消化液后，加入2mL人多能干细胞培养基，以轻柔的方式进行3-5次吹打，使细胞集落脱落并转移至15mL离心管中；此环节吹吸力度需轻柔，避免形成单细胞聚集现象。如部分细胞未能脱落属正常情况，如大量细胞未脱落，则需延长消化时间。

4. 离心：以1000rpm离心3分钟后弃去上清。

5. 接种：用干细胞培养基轻柔吹打细胞5-10次，吸去包被培养板中的基质胶，将细胞悬液加入到培养板中，并补全每孔2mL的培养体系，注意吹打细胞时要温柔，吹打次数不超过10次。

6. 换液：传代后开始每24小时更换一次培养基，保持新鲜且活性。

hPSC细胞冻存

1. 清洗：同上步骤。

2. 消化：同上步骤。

3. 吹打：同上步骤。

4. 离心：同上步骤。

5. 重悬：离心后弃去上清，加入2mLES/iPS细胞冻存液(abs9412)对干细胞沉淀进行3-5次吹吸混匀，将其装入冻存管中；注意，冻存液应即用即拿，及时置于4℃冰箱。

6. 记录：在冻存管上标明冻存细胞类型、时间、操作者及细胞批次信息。

7. -80℃冰箱冻存：冻存管需直立放置于-80℃冰箱过夜，避免斜放或横放。

8. 液氮冻存：24小时后，将细胞从-80℃转移至液氮中进行长期冻存。

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